禽波氏杆菌免疫荧光检测技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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禽波氏杆菌免疫荧光检测技术

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1　范围
本规范规定了禽波氏杆菌病间接免疫荧光检测技术的试剂或材料、仪器设备、禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）的提取、禽波氏杆菌OMP含量测定、禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备、阴性血清制备、禽波氏杆菌免疫荧光检测方法和判定标准。
本规范适用于从事家禽饲养以及从事家禽防疫活动的单位和个人禽波氏杆菌检测。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 603　化学试剂　试验方法中所用制剂及制品的制备
GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法
GB 14925　实验动物　环境及设施
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
蛋白定量Bradford法　Bradford method for protein quantitation
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595 nm波长下有最大光吸收，其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2 min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1 h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应灵敏，可测定微克级蛋白质含量。
3.2　
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳　SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS，即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素），可以用于分离蛋白质和寡核苷酸。
3.3　
免疫荧光试验　immunofluorescence test
是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
4　试剂或材料
4.1　禽波氏杆菌
禽波氏杆菌P5株，购自中国兽医药品监察所。
4.2　抗体
异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG。
4.3　生化试剂
邻苯二胺(OPD)、聚乙二醇辛基苯基醚（Tri-tonX-100）、考马斯亮兰G-250、牛血清白蛋白（BSA）、不完全弗氏佐剂、丙酮（分析纯）、乙醇（分析纯）、甘油（分析纯）。
5　仪器设备
5.1　超净工作台。
5.2　恒温培养箱。
5.3　超速冷冻离心机。
5.4　蛋白电泳仪。
5.5　微量移液器（20 μL～100 μL）。
5.6　电子天平。
5.7　超声波破碎仪。
5.8　旋涡混合器。
5.9　分光光度计（380 nm～780 nm）。
5.10　荧光显微镜。
6　禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）的提取
6.1　将保存的禽波氏杆菌株接种于200 mL肉汤培养基中，37 ℃振荡培养过夜后，离心收集过夜培养的细菌。肉汤培养基配制按附录A执行。
6.2　用10倍体积的含有10 mM MgCl2的Tris-HCl（100 mM pH7.8）缓冲液悬浮，超声波破碎（功率为500 W、破碎时间60 s、间隙60 s、反复破碎10次）。Tris-HCl缓冲液配制按附录A执行。
6.3　通过1000×g低速离心去除细胞核，上清液高速离心，10000×g，20 min。
6.4　含全膜蛋白的沉淀，用同体积的含2 % Triton X-100的Tris-MgCl2缓冲液溶解，室温下孵育30 min降解内膜蛋白后，再进行100000×g，30 min超速离心。
6.5　沉淀用缓冲液再悬浮，置-20 ℃保存备用。
6.6　SDS-PAGE电泳检测禽波氏杆菌外膜蛋白OMP的分子量。
7　禽波氏杆菌OMP含量测定
7.1　考马斯亮蓝法
7.1.1　取16支试管，1支作空白对照，3支用于检测禽波氏杆菌OMP样品，其余12支试管分为两组，每组6支，用于绘制标准曲线。
7.1.2　用移液器向每组6支试管中各加入1.0 mg/mL的标准蛋白质溶液各0.01 mL、0.02 mL、0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.1 mL，然后用去离子水补充到0.1 mL。
7.1.3　各试管中分别加入5.0 mL考马斯亮兰G-250试剂，立即在旋涡震荡器上混匀；空白对照管为0.1 mL水与5.0 mL考马斯亮兰G-250试剂的混合液。
7.1.4　加完试剂2 min～5 min后，用塑料或玻璃比色皿在分光光度计上测定各样品在595 nm处的吸光值OD595。
7.1.5　用标准蛋白质量（mg）为横坐标，吸光度值OD595为纵坐标，绘制标准曲线。根据检测样品的OD595值，计算样品中OMP的含量。
7.2　考马斯亮蓝微量法
7.2.1　样品中蛋白质浓度较稀时（10 mg/mL～100 mg/mL）采用微量法检测。
7.2.2　每支试管的蛋白溶液量加大到1.0 mL，加考马斯亮蓝G-250试剂5.0 mL，根据测定的OD595值绘制标准曲线，计算样品中禽波氏杆菌OMP的含量。
7.3　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
7.3.1　分别配制SDS-聚丙烯酰胺分离胶和浓缩胶，安装垂直电泳装置。分离胶和浓缩胶配制按附录A执行。
7.3.2　用移液器将OMP样品加至加样孔，进行电泳。
7.3.3　电泳结束，用考马斯亮蓝R250对蛋白胶进行染色，检验禽波氏杆菌OMP的提取效果。
8　禽波氏杆菌外膜蛋白（OMP）抗血清的制备
8.1　将提取的禽波氏杆菌OMP蛋白液与弗氏不完全佐剂混合（V:V=1:1），用漩涡振荡器乳化，制备禽波氏杆菌OMP免疫用抗原。.
8.2　选取体重2.5 kg的健康青紫兰家兔4只，颈背部皮下注射免疫OMP抗原，共免疫4次，每次间隔1周，OMP免疫剂量为320 μg/只/次。实验兔的饲养符合GB 14925的要求。
8.3　最后1次免疫后7 d采血，检测兔血清中禽波氏杆菌抗体的凝集价，凝集价高于1:256以上时采血，分离血清，-20 ℃保存备用。
9　阴性血清制备
采集未免疫的健康青紫兰兔血液，制备阴性血清。
10　禽波氏杆菌免疫荧光检测方法
10.1　被检禽波氏杆菌涂片的制备
10.1.1　组织涂片的制备
取临床疑似禽波氏杆菌病的鸡肝脏组织进行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15 min，用灭菌PBS（配制方法见附录A）洗涤3～4次，风干。
10.1.2　阴、阳性组织涂片的制备
用移液器吸取5 μL培养基培养的禽波氏杆菌菌液进行涂片，自然干燥后，用冷丙酮固定15 min，用灭菌PBS洗涤3～4次，风干。正常肝脏组织涂片作为阴性对照。
10.2　检测方法
10.2.1　向涂片中滴加1:10倍稀释的禽波氏杆菌OMP抗血清100 μL，置于37 ℃湿盒中孵育30 min，用PBS洗涤3次。
10.2.2　加1:100倍稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗兔IgG二抗，置于37 ℃湿盒中孵育30 min，用PBS洗涤3次。
10.2.3　用吸水纸吸干后滴加甘油，将涂片置于荧光显微镜下观察。
11　判定标准
11.1　结果有效性
阳性对照呈现明显的黄绿色荧光，阴性对照无黄绿色荧光，则检测结果有效。
11.2　结果判定
荧光显微镜中出现黄绿色荧光，判为阳性，用“+”表示；未出现黄绿色荧光，判为阴性，用“–”表示。阴阳性判定结果按附录B执行。

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