槐花多糖提取工艺生物活性评价技术_老木一支笔专业编制可行性研究分析报告_资金项目立项申请报告

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槐花多糖提取工艺生物活性评价技术

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1　范围
本规程规定了槐花多糖提取工艺及其生物活性评价技术的术语和定义、试剂或材料、仪器设备、槐花多糖的提取、苯酚-硫酸法测定多糖含量和生物活性评价等标准。
本规程适用于槐花多糖用作动物用免疫佐剂和免疫增强剂的制备和检验。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 603　化学试剂　试验方法中所用制剂及制品的制备
GB/T 6682　分析实验室用水规格和试验方法
GB 14925　实验动物　环境及设施
GB/T 14926.54　实验动物　血凝抑制试验
3　术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
分泌型免疫球蛋白A　Secretory Immunoglobulin A，SIgA
sIgA主要分布在唾液、泪液、肠胃液、乳汁以及呼吸道分泌液。在外分泌液当中，是机体黏膜免疫当中的主要抗体。在肠道黏膜免疫当中起到关键作用的是分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A，SIgA）。作为肠粘膜上的主要免疫球蛋白，它是肠道黏膜上的第一道防线，对各种内源共生菌及外源入侵的病原体都有抵抗作用。
3.2　
血凝与血凝抑制试验　hemagglutination and hemagglutination inhibition test
血凝试验（hemagglutination test，HA）是指某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验。
血凝抑制试验（hemagglutination inhibition test，HI）是指当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触，这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为血凝抑制，利用这种特性设计的试验称血凝抑制试验。
3.3　
酶联免疫吸附实验　enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA
将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。
4　试剂或材料
4.1　牛血清白蛋白（BSA），配制方法见附录A。
4.2　1%鸡红细胞：配制方法见附录A。
4.3　纤维素酶。
4.4　Sevag试剂：氯仿:正丁醇＝5:1（V/V）混合。
4.5　无水乙醇。
4.6　商品化新城疫灭活疫苗。
4.7　商品化新城疫标准抗原。
4.8　磷酸盐缓冲溶液（PBS），配制方法见附录A。
4.9　去离子水。
4.10　生理盐水。
4.11　96孔V形微量血凝板。
4.12　96孔ELISA酶标板。
4.13　鸡sIgA ELISA检测试剂盒。
4.14　抗凝管。
4.15　注射器。
4.16　密封袋。
4.17　浓硫酸。
4.18　苯酚。
5　仪器设备
5.1　恒温干燥箱。
5.2　超微粉碎机。
5.3　40目筛网。
5.4　电子天平。
5.5　pH计。
5.6　水浴锅。
5.7　旋转蒸发仪。
5.8　全自动血细胞分析仪。
5.9　分光光度计。
5.10　酶标仪。
5.11　磁力搅拌器。
5.12　移液器（10 μL～1000 μL）。
5.13　微量振荡器。
5.14　高压蒸汽灭菌器。
5.15　蒸馏装置。
5.16　分光光度计（380 nm～780 nm）。
5.17　电子天平。
5.18　坐标纸。
6　槐花多糖的提取
6.1　采集新鲜盛开的槐花，去梗后放入恒温干燥箱中于70 ℃烘干，用超微粉碎机粉碎成粉末状，过40目筛，装入密封袋，-20 ℃保存。
6.2　称取一定量的槐花粉与去离子水按体积1:25混合，用pH计调节pH至4.5，加入终浓度0.25 %的纤维素酶，45 ℃水浴中浸提1 h，提取4次，合并4次上清液，用旋转蒸发仪减压浓缩至1/5体积。
6.3　浓缩液用Sevag试剂（配制方法见附录A）除蛋白，重复两次，最后加入4倍体积的无水乙醇使多糖沉淀，对析出的多糖进行离心，冷冻干燥后即为槐花多糖。
7　苯酚-硫酸法测定多糖含量
7.1　葡萄糖标准液的配制
称取葡萄糖100 mg，蒸馏水定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后吸取10 mL该溶液，用去离子水稀释定容至100 mL，即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
7.2　90 %苯酚液的配制
量取苯酚90 mL，用去离子水定容至100 mL，即得90 %苯酚液，棕色瓶中避光保存。
7.3　6 %苯酚液的配制
将90 %苯酚液稀释至6 %，即一体积储存液对应十四体积去离子水，临用现配。
7.4　实验步骤
7.4.1　标准曲线的制作
取8支干净的带塞试管，按表1方法分别加入相应体积的葡萄糖溶液，然后在冰水浴中加入0.5 mL的6 %苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞，沸水放置20 min，取出后用凉水冷却10 min，以0号作为空白调零，在最大吸收波长处（490 nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（μg/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用excel软件求得回归方程。
表1　标准曲线的制作的试剂配制方法
管号 0 1 2 3 4 5 6 7
葡萄糖（mL） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
苯酚液（mL） 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
浓硫酸（mL） 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
7.4.2　待测样品多糖含量的测定与计算
将提取得到的待测多糖用去离子水溶解，定容至100 mL，取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，乘以稀释倍数则为多糖含量。
7.5　质量标准
用苯酚-硫酸法测的多糖含量大于80 %以上，视为提取的槐花多糖合格。
8　生物活性评价
8.1　槐花多糖对鸡免疫功能的增强作用检测
将240只SPF雏鸡，随机分为4组，每组60只。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组，于9～12日龄，每天颈部皮下注射0.25 mL槐花多糖溶液。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组槐花多糖含量分别为200 mg/mL、100 mg/mL、50 mg/mL，Ⅳ组为对照组，注射生理盐水。12日龄时各组免疫鸡新城疫灭活苗，于免疫后3 d、7 d、14 d、21 d，采样检测相关指标。实验鸡的饲养符合GB 14925的要求。
8.2　免疫器官指数
免疫7天后，各组随机取15只雏鸡，称量体重（称重前12 h停饲停水），剖杀前采集血液（检测后续指标用），分别摘取胸腺、法氏囊、脾脏并称重，计算出胸腺指数［胸腺重（g）/活体重(kg)]，法氏囊指数［法氏囊重（g）/活体重(kg)]，脾脏指数［脾脏重（g）/活体重(kg)]。
8.3　血清抗体效价的检测
免疫后3 d、7 d、10 d、14 d、21 d，采集各组雏鸡的血液，在37 ℃温箱静置2 h，分离血清，用血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验检测雏鸡血清抗体水平。血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验依据GB/T 14926.54。
8.4　白细胞数目及淋巴细胞比率的测定
用一次性医用抗凝管采集各组雏鸡的抗凝血1 mL，用全自动血细胞分析仪测定雏鸡血液内白细胞数目和淋巴细胞比率。
8.5　小肠内分泌型免疫球蛋白A（SIgA）含量的测定
雏鸡剖杀后，取10 cm长的十二指肠段，用3 mL 1 % BSA-PBS反复冲洗3次后，8000 rpm离心取上清，用商品化ELISA试剂盒检测上清中SIgA的含量。

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