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化妆品中维生素D2、维生素D3测定
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关键词:高效液相色谱法
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1 范围
本标准规定了化妆品中维生素D2、维生素D3的高效液相色谱法。
本标准适用于化妆品中维生素D2、维生素D3的检测。本方法取样量为0.5 g时,维生素D2检出浓度为3.6 mg/kg,最低定量浓度为10 mg/kg。维生素D3检出浓度为1.8 mg/kg,最低定量浓度为5 mg/kg。
2 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
3 方法提要
维生素D2和维生素D3在265 nm处有紫外吸收,可用反相高效液相色谱法分离,并根据保留时间和紫外光谱图定性,外标法定量。
试剂和溶液除另有说明外,所用试剂均为色谱纯,水为GB/T6682规定的一级水。
4 试剂和材料
4.1 甲醇。
4.2 乙腈。
4.3 维生素D2:纯度≥99.0%。
4.4 维生素D3:纯度≥99.0%。
4.5 混合标准储备溶液:分别准确称取维生素D20.1000 g及维生素D30.2000 g,移入100 mL容量瓶中,用甲醇(4.1)溶解并定容至刻度,摇匀,作为标准储备溶液。避光保持,保存期不超过2周。
5 仪器与设备
5.1 高效液相色谱仪:紫外或二极管阵列检测器。
5.2 紫外分光光度计。
5.3 超声波清洗器。
5.4 分析天平:感量0.0001 g。
5.5 有机相微孔滤膜:0.45 μm。
6 分析步骤
6.1 样品预处理
称取样品约0.5 g(精确至0.0001 g)于10 mL具塞比色管中,用流动相定容至刻度,摇匀,超声提取30 min。经0.45 μm有机相微孔滤膜过滤,滤液作为待测样液。
6.2 色谱参考条件
6.2.1 色谱柱:C18柱,250 mm×4.6 mm,5 μm;
6.2.2 检测器:二极管阵列检测器;
6.2.3 检测波长:265 nm;
6.2.4 流动相:甲醇+乙腈=90+10(HPLC分析前,经0.45 μm滤膜过滤及真空脱气);
6.2.5 流速:1.0 mL/min;
6.2.6 进样量:10 μL;
6.2.7 柱温:室温。
其它能够达到同等分离效果的色谱条件均可使用。
6.3 标准曲线的制备
6.3.1 纯度校正
由于维生素D2和维生素D3对光不稳定,因此在配置标准溶液之前需用紫外分光光度法进行纯度校正,方法如下:维生素D2和维生素D3在263 nm波长处有最大紫外吸收,而乙醇在该波长无吸收。95%乙醇溶液中,质量分数为1%的维生素D2溶液的吸光系数 为460,质量分数为1%的维生素D3溶液的吸光系数 为485,吸光系数相当于吸光度/浓度,因此通过测定吸光度可得出所配置溶液的准确浓度,进而校正纯度。维生素D2和维生素D3的纯度按照式(1)计算。
             ……………………………………(1)
式中:
   P——维生素D2、维生素D3的纯度,%;
A——维生素D2、维生素D3的吸光度,单位为毫克每升(mg/L);
C——维生素D2、维生素D3的质量分数,%;
L——比色皿的光径,单位为厘米(cm);
 ——维生素D2、维生素D3的吸光系数。
6.3.2 标准曲线的绘制
分别准确移取一定量维生素D2和维生素D3的标准储备液(4.5),用流动相将标准工作溶液中稀释成一系列浓度的标准溶液,其中标准溶液中维生素D2的浓度分别为200 mg/L、100 mg/L、80 mg/L、50 mg/L、20 mg/L、10 mg/L,标准溶液中维生素D3的浓度分别为400 mg/L、200 mg/L、160 mg/L、100 mg/L、40 mg/L、20 mg/L。按照浓度由低到高的顺序依据色谱条件(6.2)分别测定,以标准工作溶液浓度为横坐标,相应色谱峰峰面积为纵坐标,分别维生素D2、维生素D3绘制标准工作曲线。标准物质色谱图参见附录A,标准物质紫外吸收光谱图参见附录B。
6.4 试样测定
取预处理后的待测液(6.1),按照色谱条件(6.2)进行测定,记录色谱峰的保留时间和峰面积,由色谱峰的峰面积可从标准曲线上求出维生素D2和维生素D3的浓度。样品溶液中维生素D2和维生素D3的响应值均应在仪器测定的线性范围之内,维生素D2和维生素D3含量高的试样可取适量待测液(6.1)用流动相稀释后进行测定。
6.5 平行实验
按以上步骤对同一试样进行平行试验。
6.6 空白试验
除不加样品外,采用完全相同的步骤进行平行测定。
6.7 分析结果表述
维生素D2、维生素D3的含量ω按式(2)计算,计算结果应扣除空白值:
          ……………………………………(2)
式中:
ω——样品中维生素D2、维生素D3的质量浓度,单位为毫克每千克(mg/kg);
c——标准曲线查得维生素D2、维生素D3的浓度,单位为毫克每升(mg/L);
c0——根据标准曲线得到空白样品中维生素D2、维生素D3的浓度,单位为毫克每升(mg/L);
V——样品的定容体积,单位为毫升(mL);
m——样品质量,单位为克(g)。
7 允许差
在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
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