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猪伪狂犬病病毒gE基因PCR检测技术
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关键词:猪伪狂犬病病毒
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1 范围
本标准规定了猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因PCR检测技术的操作要求。
本标准适用于PRV的实验室诊断、监测和流行病学调查等。
2 实验室生物安全要求
实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。
3 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682  分析实验室用水规格和实验方法。
GB 19489  实验室生物安全通用要求。
GB/T 27401  实验室质量控制规范 动物检疫。
4 术语与定义
下列术语与定义适用于本标准。
4.1 
PCR
聚合酶链式反应。
4.2 
SDS
十二烷基硫酸钠。
5 仪器设备和试剂
5.1 仪器设备
5.1.1 微量移液器(最大量程分别为10 μL、20 μL、100 μL、1000 μL),带滤芯的枪头。
5.1.2 20000 r/min低温高速离心机。
5.1.3 电热恒温水槽。
5.1.4 稳流稳压电泳仪。
5.1.5 水平电泳槽。
5.1.6 凝胶成像系统。
5.1.7 紫外透射反射分析仪。
5.1.8 电磁炉。
5.1.9 烧杯(1000 mL)。
5.1.10 电子天平 精度为:0.001 g。
5.1.11 PCR扩增仪。
5.1.12 组织匀浆器或研钵。
5.1.13 -20 ℃冰柜。
5.1.14 2 ℃~8 ℃冰箱。
5.2 试剂
除另有规定外,所有生化试剂均为分析纯。
5.2.1 蛋白酶K(见附录A.1)。
5.2.2 10 %SDS液(见附录A.2)。
5.2.3 70%乙醇(见附录A.3)。
5.2.4 1.0%琼脂糖凝胶(见附录A.4)。
5.2.5 DNA Marker 2000。
5.2.6 超纯水:符合GB/T 6682,三级。
5.2.7 引物:
PRV-Fwd:5-CTGGCTCTGCGTGCTGTG-3;
PRV-Rev:5-GGTCCATTCGTCACTTCCG-3;
扩增片段长度348 bp。
6 操作程序
6.1 样品的采集和处理
6.1.1 样品的采集
临床上猪的脑组织、淋巴结等,置于-20 ℃冰柜或液氮中保存。
6.1.2 样品的处理
6.1.2.1 取猪的脑组织、淋巴结等约5 g于研钵中,用剪刀剪碎,加入2 mL PBS缓冲液,研磨。
6.1.2.2 阳性对照处理:含有PRV gE基因的DNA。
6.1.2.3 阴性对照处理:灭菌双蒸水。
6.2 DNA的提取
用蛋白酶K裂解法提取总DNA。
6.2.1 取研磨液500 μL于1.5 mL离心管中,加入50 μg/mL的蛋白酶K 5 μL,加入10%的SDS溶液25 μL,55 ℃水浴2 h~3 h。
6.2.2 加入200 μL Tris饱和酚,充分混匀,10000 g离心15 min。
6.2.3 取上清于一新的离心管中,加入200 μL Tris饱和酚和200 μL氯仿,10000 g离心15 min。
6.2.4 取上清于一新离心管中,加入200 μL氯仿,10000 g离心15 min。
6.2.5 取上清于一新离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-20 ℃静置20 min,10000 g离心15 min,弃上清。
6.2.6 加入70 %的乙醇冲洗沉淀表面及管壁,弃乙醇,晾干。
6.2.7 加入100 μL灭菌双蒸水溶解沉淀,-20 ℃保存备用。
试验中同时设立含有PRV gE基因的DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。
6.3 PCR
PCR为50 μL体系,按表1中1~7的循序配制。
 PCR反应体系(50μL)
序号 体系组成 体系含量
1 灭菌双蒸水 37.5 μL
2 DNA 4 μL
3 10 mmol/L上游引物 0.5 μL
4 10 mmol/L下游引物 0.5 μL
5 10×PCR Buffer 5 μL
6 2.5 mmol/L dNTPs 2 μL
7 Taq酶 0.5 μL
首先加入双蒸灭菌水,然后按顺序逐一加入上述成分,每次要加入到液面下。全部加完后,混悬,瞬时离心,使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,循环30次,72 ℃延伸10 min结束。
6.4 电泳
6.4.1 制备1.0 %琼脂糖凝胶板,见附录A.4。
6.4.2 取5 μL PCR产物与0.5 μL加样缓冲液混合,加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。
6.4.3 加入分子量标准。
6.4.4 盖好电泳仪,插好电极,5 V/cm电压电泳,30 min~40 min。
6.4.5 用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。
6.4.6 用分子量标准比较判断PCR片段大小。
7 结果判定
7.1 在阳性对照出现348 bp扩增带、阴性对照无此扩增带时,实验结果成立(参见附录A.5)。
7.2 被检样品出现348 bp扩增带判定为伪狂犬病病毒gE基因阳性,未出现相应扩增带的样品判定为伪狂犬病病毒gE基因阴性。
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