1　范围
本标准规范了脉红螺Rapana venosa（Valenciennes, 1846）的名称与分类、主要生物学性状、繁殖特性、遗传特性、检测方法和判定规则。
本标准适用于脉红螺种质检测与鉴定。
2　规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 18654.2  养殖鱼类种质检验  第2部分：抽样方法
GB/T 18654.12  养殖鱼类种质检验  第12部分：染色体组型分析
3　名称与分类
3.1　名称
脉红螺Rapana venosa（Valenciennes, 1846），别名红皱岩螺、强棘红螺、角皱岩螺。
3.2　分类地位
软体动物门（Mollusca），腹足纲（Gastropoda），新腹足目（Neogastropoda），骨螺科（Muricidae），红螺属（Rapana）。
4　分布
为暖温性种类。生活在数米或二十余米的浅海泥砂、软泥或碎贝壳质海底，幼螺常见于潮间带岩礁间。分布于我国辽宁至福建沿海，南限为福建厦门；日本北部、朝鲜半岛和俄罗斯远东海，以及红海和黑海等地均有分布。
5　主要形态特征
5.1　外部形态特征
5.1.1　贝壳
坚而厚，略近梨形，呈黄褐色，通常具有紫褐色或红棕色花纹或斑点，个体较大者壳高可达170 mm～180 mm。
5.1.2　壳口
长卵圆形，内部呈橘黄色、杏红色或伴有黑白相间条纹。外唇边缘有棱角，内缘有褶襞；内唇弧形，滑层厚并向外扩展，与发达的绷带共同形成假脐。前水管沟宽短。
5.1.3　螺层
约6层，缝合线浅而清楚；螺旋部低，体螺层宽大，基部收缩。各螺层的中部和体螺层的上部具有明显的肩角，肩角上有结节或棘状突起。体螺层上有4条较粗壮的螺肋，以肩部的一列最强大，肋上具有结节突起。
5.1.4　厣
为角质，坚厚，椭圆形，褐色。
脉红螺外部形态见图1。
 
图1　脉红螺外部形态
5.2　内部构造
5.2.1　齿
齿式：（0.1.1.1.0）×131，中央齿短，顶端具3枚大型锥状齿尖，中央1枚较大，两侧2枚较小，整体呈“山”字形。侧齿每侧1列，每枚侧齿基部宽，顶部呈尖锥状，稍弯曲。无缘齿。
5.2.2　消化系统
由消化管和消化腺两大部分组成。消化管包括吻、咽、食道、胃、肠、直肠和肛门，消化腺包括唾液腺、副唾液腺、勒布灵氏腺、肝和肛门腺。
5.2.3　神经系统
中枢神经系统由食道神经环、脏神经节和两条侧脏神经连索构成，外周神经系统由外周神经和外周神经节构成。
5.2.4　循环系统
由心脏、动脉系统、血窦、经脉系统和血液组成。
5.2.5　生殖系统
雄性生殖系统由精巢、输精小管、贮精囊、输精管、前列腺、输精管外套和阴茎等组成，雌性生殖系统由卵巢、输卵小管、输卵管、纳精囊、蛋白腺和产卵器等组成。
6　遗传学特性
6.1　染色体数目
脉红螺二倍体体细胞染色体数为：2n=64。
6.2　线粒体基因片段分子特征
6.2.1　16S rRNA基因片段序列位点
片段长度为505 bp。线粒体基因片段检测特征见图2，所测得的16S rRNA基因片段序列位点为：
图2　脉红螺肌肉组织16S rRNA基因片段凝胶电泳图谱
6.2.2　COI基因片段序列位点
片段长度为644 bp。线粒体基因片段检测特征见图3，所测得的COI基因片段序列位点为：

7　生长与繁殖
7.1　生长
自然条件下，半年全长可达20 mm，翌年春季一般可达30 mm～40 mm，最终壳高可达170 mm～180 mm。
7.2　繁殖
7.2.1　繁殖方式
雌雄异体，体内受精。
7.2.2　繁殖期
每年只有一个繁殖期。不同海区繁殖季节有差异，山东沿海繁殖期在6月～8月(水温19 ℃～26 ℃)，产卵盛期在7月(水温22 ℃～24 ℃)，辽宁沿海繁殖期在6月下旬～7月中旬。
7.2.3　产卵习性
最小生物学年龄为1龄，壳高45 mm，性腺一年成熟一次，多次交尾、产卵，包裹于卵袋内产出。
7.2.4　繁殖水温
16 ℃开始交配，孵化水温20 ℃～28 ℃，最适孵化水温22 ℃～25 ℃。
7.2.5　产卵量
平均产卵2次～3次，产卵袋600个～700个，每个卵袋平均含受精卵1000粒～2000粒。
8　检测方法
8.1　抽样
按GB/T 18654.2的规定执行。
8.2　染色体和核型检测
8.2.1　染色体标本制备
标本制备主要步骤如下：
a) 实验用螺于0.005 %秋水仙素（海水配制）中充气暂养8 h～10 h，剪取一小块鳃组织；
b) 用50%的过滤海水低渗处理30 min；
c) 0.075 mol/L KCl低渗25 min；
d) Carnoy氏液固定3次，每次15 min～20 min；
e) 50 %冰醋酸解离20 min～30 min，轻轻吸打；
f) 50 ℃左右温片滴片；
g) 烘干后10 % Giemsa染液（pH值6.8）染色30 min；
h) 自来水冲洗，自然干燥后镜检。
8.2.2　核型分析
观察100个左右的分散良好的中期分裂相，记数确定二倍体数。从中挑选10个分散良好、形态清晰的中期分裂相进行显微摄影、放大、测量，按GB/T 18654.12的分类标准对染色体分类。
8.3　线粒体基因片段分子特征检测
8.3.1　DNA提取
取脉红螺腹足肌肉30 mg，剪碎至糜状，使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
8.3.2　引物序列
以脉红螺基因组为模板，分别用无脊椎动物16S rRNA和COI基因序列通用引物进行扩增。引物序列见表1。
表1　引物序列
D16sar 5’-CGCCTGTTTAHYAAAAACAT-3’
D16sbr 5’-CCGGTCTGAACTCAGMTCAYGT-3’
LOC1490 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’
HOC2198 5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’
8.3.3　PCR反应体系
25 μL PCR反应体系组分见表2、3。
表2　25 μL 16SrRNA基因PCR反应体系组分
PCR Mix 12.5 μL
D16sar (10 μM) 0.5 μL
D16sbr（10 μM） 0.5 μL
DNA模板(100 ng/μL) 1 μL
H2O 10.5 μL

表3　25 μL COI基因PCR反应体系组分
PCR Mix 12.5 μL
LOC1490 (10 μM) 0.5 μL
HOC2198（10 μM） 0.5 μL
DNA模板(100 ng/μL) 1 μL
H2O 10.5 μL
8.3.4　PCR程序
8.3.4.1　16S rRNA 基因PCR程序
95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，50 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，经72 ℃延伸，10 min后15 ℃保存。
8.3.4.2　COI基因PCR程序
95 ℃预变性5 min，之后30个循环（95 ℃变性50 sec，48 ℃退火50 sec，72 ℃延伸1 min），经72 ℃延伸，10 min后15 ℃保存。
8.3.5　琼脂糖凝胶电泳
8.3.5.1　TAE（凝胶缓冲液和电泳缓冲液）的制备
Tris 242 g，Na2EDTA•2H2O 18.6 g，800 mL去离子水，57.1 mL的冰乙酸，用NaOH调pH至8.3，去离子水定容至1 L。使用时稀释50倍。
8.3.5.2　分析样品的制备
电泳前取2 μL PCR产物与0.8 μL 的上样缓冲液混合后备电泳用。
8.3.5.3　凝胶制备
加琼脂糖4 g和制胶缓冲液（TAE）400 mL，在三角烧瓶内混匀，加热至沸腾，然后注入制胶模具中，冷却后，保鲜膜密封保存备用。
8.3.5.4　电泳步骤
将Marker和PCR产物加入点样孔，上样完毕后，在室温条件下以120 V～150 V电压进行电泳，电泳时间依线粒体基因片段的不同而不同，当PCR产物跑至凝胶1/2～2/3处即可。
8.3.5.5　染色
电泳结束后，将琼脂糖凝胶水平置于盛有3 %EB的染色液的染色盒中进行染色，染色15 min左右。
8.3.5.6　摄影、扫描
用凝胶成像系统对谱带进行显像和拍照。
8.3.5.7　结果分析
将所得PCR产物进行纯化回收，采用双向测序并对测序结果进行人工校对。测得序列通过Bioedit软件进行多序列对比和分析。采用MEGA5.0软件分析序列的碱基组成以及两两群体间的遗传距离，并构建NJ系统树。采用DNASP软件分析所得序列的多态位点数、核苷酸多样性、单倍型多样性等相关遗传多样性参数。
9　判定规则
被检样品符合本标准的第5章和第6章要求的为合格样品。如果有一项不符合的可以复检，复检不合格的判定为不合格，复检合格的判定为合格。合格样品数与样品总数的比为合格率。